蛋白纯化技术中的凝胶过滤层析方法是一种基于分子大小差异进行分离的技术。以下是对凝胶过滤层析方法的详细叙述：
工作原理
凝胶过滤层析法，也称为大小排阻、凝胶排阻、分子筛或凝胶过滤层析，利用分级分离的原理，不需要蛋白质的化学结合，从而降低了因不可逆结合导致的蛋白质损失和失活。在这种方法中，样品通过一个由微孔大小不同的凝胶组成的柱子，较大的蛋白质分子无法进入凝胶微孔，而较小的蛋白质则能够进入微孔中，从而实现了蛋白质的分离。
操作步骤
1. 准备凝胶柱：通常使用细致度不同的凝胶填充层析柱，根据目标蛋白的分子大小选择合适的凝胶。
2. 装载样品：将样品加到凝胶柱上，通过差异排除法分离不同大小的蛋白质。
3. 洗脱杂质：使用缓冲液冲洗凝胶柱，将未结合的杂质从柱中洗出。
4. 收集目标蛋白：通过调整洗脱缓冲液的条件，使目标蛋白质从凝胶柱中洗脱下来。
5. 收集纯化的蛋白质：收集洗脱液中的目标蛋白质，即得到纯化的蛋白。
技术优势
• 非侵入性：不需要添加化学试剂或改变样品的pH，避免了对蛋白质性质的干扰。
• 保持生物活性：由于是基于分子大小分离，不会对蛋白质的生物活性造成影响。
• 适用性广泛：适用于各种类型的蛋白质，不受其电荷性质的影响。
应用领域
凝胶过滤层析法广泛应用于生物制药、生物学研究等领域：
• 蛋白质和肽的分离：成功纯化了数千种来自不同来源的蛋白质和肽，包括**性蛋白和肽、工业用酶和蛋白。
• 核酸和核苷酸的分离：用于分离各种核酸种类，如DNA、RNA以及它们的构成碱基。
• 病毒颗粒的分离：用于从细胞培养中连续分离流感病毒和污染蛋白。
凝胶过滤层析的相位
• 流动相：通过柱子循环的溶剂是流动相。测试样品必须首先在适当的有机溶剂中稀释，然后过滤并通过柱子运行。
• 固定相：微孔凝胶珠排列在柱中，作为固定相。凝胶过滤层析经常使用交联聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶和羟基丙基Sephadex作为支撑材料。
分离机制
在凝胶过滤层析中，小分子会进入凝胶孔隙，导致在柱上的停留时间更长；而大分子由于分子大小较大，不能轻易通过柱子或进入凝胶珠的孔隙，因此分离在不同点发生。任何分子或复合物，如果大小超过了给定凝胶过滤层析柱的分离范围，将会比任何能够进入固定相的分子更快地通过柱子。
凝胶过滤层析是一种简单、可靠、多功能且易于放大的纯化技术，它在生物分子分离领域占有重要地位。通过这种方法，可以实现蛋白质的纯化，同时保持其稳定性和活性，这对于生物制药和生物医学研究至关重要。
凯奥嘉生物专注于医药、临床诊断、实验室封板膜,微孔板热封膜产品的开发、生产及销售,并可根据客户多样化需求进行产品定制与项目合作。 凯奥嘉生物致力于为客户提供更为合理优化的样本密封解决方案，持续助力生命健康产业的发展。