降落PCR（Touchdown PCR）
降落PCR是一种通过对反应体系中退火温度进行优化来提高反应特异性的PCR技术。在降落PCR中，根据引物的Tm值（熔点），设置一系列从高到低的退火温度。在*开始循环中的退火温度高于引物的Tm值，之后每一个（或n个）循环降低1℃（或n℃）退火温度，直到退火温度降低到*佳温度（通常比引物的Tm值低2~5℃），剩余的循环都维持此退火温度。
降落PCR的基本原理在于，一开始使用较高的退火温度可避免引物二聚体和非特异性产物的形成，保证扩增产物的特异性。较高的退火温度可以使得只有完全匹配的引物和模板才能结合，从而减少了非特异性扩增的可能性。之后的循环中逐渐降低退火温度，可以提高扩增的效率。因为在初始循环中，特异性产物的量已经达到一定丰度，后续低退火温度扩增循环中，虽然扩增的特异性降低，但非特异位点结合的竞争力要低于特异性位点，因此产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。
降落PCR适用于不确定引物的*适Tm值，或引物扩增效果不佳时。此外，当不了解目的模板同源性程度时，使用降落PCR可以快速、特异地得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
巢式PCR（Nested PCR）
巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。通常涉及两轮连续PCR反应，需要设计两对引物，**轮PCR是用一对外引物扩增得到包含目的片段的较长产物，将其经过稀释以后作为**轮PCR的模板，再用另一对内引物（巢式引物，位于**轮PCR产物的内部）进行**轮PCR，得到的产物为目的片段。
巢式PCR的好处在于，如果**次扩增产生了错误片段，则**次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因为**对引物（内引物）位于**轮PCR扩增片段的内部，只有正确扩增的产物才包含**轮引物的结合位点，从而大大提高了扩增的特异性。
巢式PCR大多应用于模板DNA含量较低的情况，一次PCR难以得到满意的结果，用巢式PCR的两轮扩增可以得到足够的特异性产物。此外，巢式PCR还具有高灵敏度的特点，因为进行两轮PCR扩增可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制。巢式PCR广泛应用于动物方面，如病毒、梅毒螺旋体、HIV、肿瘤基因等的检测和研究。
数字PCR（Digital PCR, dPCR）
数字PCR是一种*新的核酸分子**定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
数字PCR具有许多优点。首先，它是一种**定量的方法，不需要依赖传统的标准曲线或对照样品。其次，数字PCR具有高灵敏度和高精度，可以检测到非常低浓度的目标核酸。此外，数字PCR还具有高特异性和高重复性，适用于各种复杂样本的分析。数字PCR在基因表达和拷贝数检测、低频等位基因的辨别、病毒滴定和二代测序文库的**定量等方面具有广泛的应用前景。
重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR, SOE PCR）
重叠延伸PCR技术（SOE PCR）采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链。在随后的扩增反应中，通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。
重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。引物的设计需要确保它们能够形成互补的重叠链，并且在拼接后产生正确的基因序列。在重叠延伸PCR的过程中，首先使用**对引物进行**轮PCR扩增，得到包含重叠区域的两个片段。然后，将这两个片段混合在一起作为模板，使用**对引物进行**轮PCR扩增。在**轮扩增中，两个片段通过重叠区域的互补链延伸而拼接在一起，形成完整的基因序列。
重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。例如，在构建融合基因时，可以通过设计具有互补末端的引物，将两个不同来源的基因片段拼接在一起。在基因定点突变中，可以通过设计包含突变位点的重叠引物，将突变引入目标基因中。此外，重叠延伸PCR还可以用于长片段基因的合成和基因敲除等研究。
总的来说，降落PCR、巢式PCR、数字PCR和重叠延伸PCR都是实验室中常用的PCR技术，它们各自具有独特的特点和适用范围。了解这些技术的原理和应用，有助于更好地选择和使用它们进行科学研究。
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